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关于寡核苷酸合成终产量的“真香定律”,你get了没?

2022/9/9 15:09:29 浏览次数:952

关于寡核苷酸合成终产量


你get了没?


随着寡核苷酸黄金时代的来临(戳我浏览核酸化学的“黄金时代”),为寡核苷酸合成造就越来越丰富的应用场景。


合成是为了获得尽可能多的、完美匹配下游应用的终产量,同时需要保证产物的质量,还要考虑如何能够有效维系合成过程的高偶联效率,以及成本的节约等等。那么,什么是合成终产量?合成终产量的影响因素有哪些?各个因素又是如何影响着合成终产量的?怎样改进各因素对合成终产量的不利影响?成本的节约只是单纯地对标极短的合成时间吗?本期文章将通过以下三个方面来为您一一解答。


  1. 合成终产量的理论值计算方法

  2. 影响合成终产量的因素

  3. 提升合成终产量的方法


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01

合成终产量的理论值计算方法

寡核苷酸合成终产量的理论值可根据以下公式计算:


Yieldth = XY

"X" 代表平均偶联效率

average coupling efficiency),


"Y" 代表偶联步骤(coupling)数量。


例如,合成平均偶联效率为99%的30 mer寡核苷酸(29个偶联步骤),理论上可得75%产量(0.9929)。然而,若以98%的效率进行相同的合成,最大合成终产量仅为56%。


而在实践中,即使偶联效率为99%,所能期望的最高合成终产量也仅为50%。在偶联效率为98%时,合成终产量甚至低达25%。


02

影响合成终产量的因素

偶联效率(coupling efficiency)

合成仪

含水量

化学修饰

专业的技术人员及成熟的合成工艺

合成后的脱保护

纯化

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偶联效率

(coupling efficiency)

合成的偶联效率对终产量非常重要,决定了寡核苷酸可以合成长度以及最终产品的质量。偶联效率下降仅几个百分点就会大大降低实际产量,而且会影响下游纯化。


在每个合成周期中(each cycle of synthesis),化学或物理因素的限制使得偶联效率无法达到100%,因为即便使用精细的化学合成试剂,总会有一些 support-bound 寡核苷酸不会偶联。由此,每个合成周期都会产生小于百分比 n-1 产物(<1%),并会逐步积累。随着序列长度的增加,n-1 产物的总百分比也会增加。99.4%偶联效率的20 mer寡核苷酸预估产量为89.2% FLP(full-length product),而具有相同偶联效率的50 mer寡核苷酸预估产量为74.5% FLP。寡核苷酸长度、偶联效率和FLP百分比之间的关系参看下图。

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如图所示,合成的偶联效率决定着合成产量及合成长度。


平均偶联效率(average coupling efficiency)所对应的终产量可参看下表数据。

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合     成     仪

合成仪的良好性能有助于高效的合成实验,虽然事实上,维持每台合成仪每天的合成效率达到99%或更高是很难的,但是优质的合成仪可以作为提升并保持高效合成效率的前提和保障。


那么,合成仪值得关注的性能参数主要指那些?

1

在合成较长链且可获得一定的产物得率的背景下,合成效率可达99%以上。

单一合成效率的数据缺乏严谨性与可信度,具备合成长度及规模的前提是必要的,这样的合成效率数据才能使用户了解到更加真实准确的合成效率,为实际应用做好准备。

在保证终产物质量的前提下,

合成时间越短越好,可以有效节约成本。

2

单一的合成时间(或每个碱基的合成时间)数据并不具有参考性,具备合成序列长度及终产物的质量背景是必要的,这样合成时间的数据才有意义,才具有数据对比的可信性。

3

合成规模范围广

仪器功能选择多样且全面,灵活

4

5

软件使用满足定制化需求,操作便捷,设计人性化


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含     水     量

寡核苷酸化学合成对水分极其敏感,环境的湿度,合成试剂/乙腈的含水量,配制单体质量的完美度,都将对合成终产量产生影响。


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化   学   修   饰

通常合成化学修饰的产物具有较差的偶联效率,使偶联效率低至90%的情况也并不罕见。修饰若是通过与胺,硫醇或羧基官能团偶联而制备,会受到诸多因素的影响,包括试剂的质量和新鲜度,寡核苷酸的序列和缓冲液的质量等等,即便是普通的共轭也可以对最终产品的产量产生相当大的不利影响。


不同碱基的修饰其偶联效率无法达到100%。例如:4个常见 DNA 碱基的标准偶联效率可达98-99.5%,而有些修饰碱基的偶联效率可能低至50%。


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专业的技术人员

及成熟的合成工艺

经验丰富的技术人员及成熟的合成工艺对高效寡核苷酸的合成来说必不可少。


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合成后的脱保护

对于没有复杂化学修饰的寡核苷酸,只要脱保护试剂是新鲜的,不会有太大影响。特定的修饰需要非常温和的脱保护条件,但是碱基可能无法完全去除保护基团。在大多数情况下,碱基本身也会因脱保护反应会有一些损伤,尤其对荧光染料标记的产物会有不利影响,导致较低的产率。


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纯        化

纯化是可能会损失大部分产量的步骤,即便高质量的合成只是将适量的杂质去除,也会损失一大部分产物。中等和较差质量的合成会有更多的杂质,为纯化带来更大的难度从而对产量有更加不利的影响。因此,无论合成质量如何,纯化过程的整个过程都会导致较低的总得率。在多种因素的影响下,理论产量的50%左右可被消耗。


此外,寡核苷酸上的修饰会导致产物与较短的片段共洗脱,因此纯度对产量会有相当大的影响,90%和95%的纯度差异导致可能相差几倍的终产量。


03

提升合成终产量的方法

虽然合成产物的损耗是必然的,但是尽可能地增加产量及减少产物的不必要损耗一直是技术创新与优化的动力和追求。对合成终产量的提升,可以从以下几方面着手:

1

使用高质量合成试剂

采购并使用具有质量认证的试剂、耗材等,合成实验所用的所有试剂需确保其新鲜度。

优化合成工艺

2

合成实验前仪器的准确校准是十分重要且必要的。在保证合成效率的前提下,合理优化合成反应时间。合成产量与合成效率非常非常的紧密相关,越高的合成效率往往需要越长的合成时间。单纯追求合成时间的缩短,必然会带来合成效率的折损导致产量的大幅下降,反而会轻易增加更多更多成本的投入。

3

使用性能参数优佳的合成仪

在对比各品牌仪器的性能参数时,具备一定前提和背景的数据才是有意义且值得参考的。比如,在合成较长链且可获得一定的产物得率的情况下,合成效率可达99%以上;多长的某种序列,合成质量满足于何种应用场景,合成时间越短才越有优势。

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Reference:

  • Brown T, Brown T, Jr. (2005-2015) Solid-phase oligonucleotide synthesis. [Online] Southampton, UK, ATDBio. (Accessed October 6, 2015.)

  • Hogrefe R. (2015) A Short History of Oligonucleotide Synthesis. [Online] San Diego, TriLink BioTechnologies. (Accessed October 8, 2015.)

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