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体外诊断的昨天-今天-明天

体外诊断专题——体外诊断的分类和市场细分

一、什么是体外诊断(IVD)?

体外诊断,即IVD(InVitroDiagnosis),是指在人体之外通过对人体的血液、体液、组织等进行检测获取临床诊断信息的产品和服务。体外诊断产品广泛应用于临床的各个阶段,贯穿于初步诊断、治疗方案选择、有效性评价、确诊治愈等疾病治疗全过程。目前,临床诊断信息的80%左右来自体外诊断,被称为“医生的眼睛”,是最大的医疗器械细分领域,在2016年全球医疗器械市场中占比约13%。

图1 2016年IVD领域依然是最大的医疗器械细分市场,占比13%

二、IVD产品的分类

1.按运用对象分类

体外诊断按运用对象可分为中心实验室用和即时检测产品(POCT,Point-of-CareTest)。两者的主要区别在于:
1)即时性和易操作性差异。由于POCT无需中心实验室,可直接在患者身旁进行检测,能快速进行诊疗、护理、病程观察,进而提高医疗质量,故在ICU、手术、急诊、诊所及患者家中渗透率均逐步提高。

2)试剂与分析仪器的匹配性。在应用体外诊断试剂进行检测时,一般需要使用相应的检测仪器来分析结果(除了胶体金、生物芯片等技术)。中心实验室用的检测仪器一般是开放式系统,任何厂家的试剂在同一台仪器上均可获得检测结果;而POCT诊断仪器多为封闭系统(如我们熟悉的血糖仪),检测试剂和检测仪器需要进行严格匹配(所以很多POCT厂商通过免费或低价销售仪器,带动耗材赚钱)。

图2 按运用对象对IVD产品分类

2.按技术类型分类

按IVD产品的生产技术和检测领域,可以分类为生化诊断(clinicalchem)、免疫诊断(immunoassay)、分子诊断(MDx)、元素诊断、微生物诊断、尿液诊断、凝血类诊断、组织诊断、血液学和流式细胞诊断等。其中,前三类为我国医疗机构的主流IVD方式,也是本系列研究重点要分析的细分领域。

(1)生化诊断
生化诊断是指有酶反应参与或者抗原抗体反应参与,主要用于测定酶类、糖类、脂类、蛋白和非蛋白氮类、无机元素类等生物化学指标、机体功能指标或蛋白的诊断方法。生化诊断试剂主要是针对血常规、尿常规、肝功能、肾功能、胰腺、糖尿等疾病的诊断试剂,是最早实现自动化的检测手段,也是目前最常用的体外诊断方法之一。例如各类测量血糖、尿常规的试纸、溶剂等产品,都属于生化诊断范围。

(2)免疫诊断
免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。免疫诊断试剂在诊断试剂盒中品种最多,广泛应用于医院、血站、体检中心,主要用于肝炎检测、性病检测、肿瘤检测、孕检等。

(3)分子诊断
亦称基因诊断,应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术。分子诊断是预测诊断的主要方法,通过编码与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子基因的检测。分子诊断主要用于:
感染性疾病检测领域:宫颈癌、性病、病毒性肝炎、HIV等。
遗传性疾病诊断,例如地中海贫血等。

血液筛查,采用免疫诊断试剂对病毒血清进行检测,但由于病毒变异、血清转换窗口期、免疫静默期感染等原因造成免疫诊断局限,导致运用免疫诊断方法进行血液筛查可能造成漏检,后果严重,而分子诊断由于检测效率及灵敏度高,能够有效缩短检测窗口期等优势,现逐步成为血液筛查领域的主流技术。

分子诊断技术同样可以在肿瘤诊断、器官移植、法医物证鉴定、亲子鉴定、个性化医疗、个性化用药等诸多涉及基因核酸鉴定、匹配的领域应用。

图3 IVD产品的分类与比较


3. 各类产品的市场份额
截至2015年,全球IVD产品市场中,POCT产品占比29%,居于细分行业之首;免疫诊断、微生物诊断和生化诊断依然是较大的市场板块。
图4 全球IVD市场细分


我国体外诊断细分市场,免疫诊断与生化诊断占据半壁江山,合计将近60%。POCT产品仅占11%。

图5 我国IVD产品细分

根据海外的发展经验来看,近四年来:

(1)生化诊断产品的平均增速最低,为6%,其市场份额面临被压缩的风险,特别是在国内仍属于第二大品种,其他品种对其的替代效应尚未完全显现,故预计其国内增速将低于行业平均水平;

(2)免疫诊断产品凭借技术不断更替和高性价比在全球市场获得了收入的两位数增长(平均增速11%)。在我国,免疫诊断已替代临床生化占据35%的主流市场份额,由于分子诊断受技术和成本的影响,短期内很难快速普及,因此免疫诊断试剂的主流地位仍将保持较长时间,增速预计也将快于行业水平。

(3)分子诊断在全球层面起步较早,技术日益成熟,需求已快速释放,平均增速约10%。而我国该细分品种年平均增速高达20%。

(4)另一潜力巨大的细分品种为POCT,国内市占率仅为全球市占率的1/3。

综上,未来5-10年,我国IVD市场的份额会逐步向分子诊断和POCT倾斜。

体外诊断(二)——技术脉络和进展
1.1 IVD产品生产技术的发展路径
图1 体外诊断产品的发展路径

整体而言,体外诊断技术的发展经历了三个时期。上世界中叶之前,一直处于实验生物学时期,体外诊断的技术非常传统,检验范围有限;50年代以后,免疫诊断开始发展,分子诊断技术出现;2000年以后,免疫诊断技术不断成熟完善,分子生物学技术广泛应用到体外诊断领域中。

1.生化诊断
生化诊断产品不论在国内亦或海外都已熟透,技术壁垒低,面临被其他更精确快速的诊断技术完全替代的风险,国内寡头中生北控(8247.HK)、科华生物、利德曼等对市场的垄断力非常强劲。

2.免疫诊断
免疫诊断在海外发展了60多年,技术较成熟。与生化诊断不同,免疫技术和后来兴起的分子技术体外核酸扩增技术(PCR)目前对同类疾病诊断的特异度和灵敏度几乎平分秋色,所以近期被替代的风险小,主要是内部的技术升级换代——国外是寡头边垄断着市场边自我升级;国内则处于大洗牌期,跟不上国外寡头升级节奏的就只能抱憾出局。

免疫诊断领域技术的发展经历了多个阶段。目前同位素放射免疫由于环境污染问题已基本被淘汰。根据2015年的市场数据分析,我国免疫诊断市场中,酶联免疫占据约60%的市场份额,化学发光占据约40%的市场份额;而国外市场中,发光诊断的市场份额高达90%,占据免疫诊断的主要市场份额。而化学发光集多项优点于一身,成为免疫诊断的主流方向,是IVD行业中的黄金细分领域。

3.分子诊断
目前在耐药性治疗和研究中,主要采用细菌培养方法及分子诊断方法做药敏实验。细菌培养方法耗时长,实验结果需要2-5天甚至更长时间才能得出。分子诊断直接针对微生物DNA变化而做出检测,实验结果只需几个小时,能快速发现微生物是否具有耐药性。尽管肿瘤耐药性的发生机制十分复杂,至今还未了解其本质,但是医学界比较公认是,化疗失败主要与癌细胞对化疗药物具有或产生了耐药性有关,现已发现多种与肿瘤多药耐药相关的分子或基因。因此,在肿瘤耐药性的研究中,分子诊断具有不可替代的作用。

分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一,相比免疫诊断,优势在于诊断结果更加精准,并且可以诊断遗传性疾病。分子诊断的常规技术包括:(1)聚合酶链式反应(PCR);(2)DNA测序(DNAsequencing);(3)荧光原位杂交技术(FISH);(4)DNA印迹技术(DNAblotting );(5)单核苷酸多态性(SNP);(6)连接酶链反应(LCR);(7)基因芯片技术(genechip)。其中,PCR产品占据目前分子诊断的主要市场,基因芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。

PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短,可进行定性、定量检测,广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等,填补了早期免疫检测窗口期的检测空白,为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。主流的PCR技术据说比当下主流免疫技术的壁垒低,国内市场处在“伪寡头真红海”的局面。

基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶,综合了多种现代高精尖技术,被专家誉为诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大,目前产品种类很少,只用于科研和药物筛选等用途。

历经20余年发展,我国分子诊断历程主要分三个阶段:
第一阶段:中国分子诊断行业发展始于20世纪60年代,80年代出现核酸探针放射性核素标记、点杂交、Southern印迹杂交和限制性片段长度多态性连锁分析为代表技术的分子诊断技术。全国重点城市一些研究单位开始陆续建立了地中海贫血、苯丙酮酸尿症、血友病、杜兴氏肌营养不良、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G-6-PD缺乏症)等几个常见遗传病的分子诊断方法。

第二阶段:20世纪90年代,由于PCR技术的推广应用,分子诊断技术在中国得到了较快发展,开始进入临床实验室。除单基因遗传病外,肿瘤、感染性疾病、基因多态性、多基因遗传病等也被纳入分子诊断的范围,几乎所有的实验方法都建立在PCR技术的基础上。

第三阶段:90年代后期以来,伴随着人类基因组计划的启动(1994年)以及中国正式参与国际人类基因组计划(1999年),分子诊断开始从关注单个基因转向关注整个人类基因组。而受益于PCR荧光技术应用及基因芯片技术的开发和推广,尤其是高通量DNA测序技术的突破性进展,我国分子诊断行业开始步入高速成长阶段。

1.2 主要的免疫诊断技术简介

1.免疫诊断的几类技术

(1)胶体金法
胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

胶体金法是非常成熟的技术,广泛用于肝炎、艾滋病、早孕等检验试剂产品。

图3 胶体金法试剂的应用示例



(2)酶联免疫(ELISA)
酶联免疫(ELISA)是让抗体与酶复合物结合,既保留抗体免疫活性,又保留酶的活性,然后通过显色来检测。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

图4 酶联免疫的原理图
ELISA也是非常成熟的技术,已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物和食品检疫方面,ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

(3)化学发光法
化学发光免疫法(ChemiLuminescence,简称为CL)是分子发光光谱分析法中的一类。化学发光是伴随化学反应过程所产生的光的发射现象,当某些物质在化学反应时吸收了反应过程中的化学能,使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态,当电子从激发态回复到稳定的基态时,多余的能量以发射光子的形式释放出出来,这一现象称为化学发光。

化学发光免疫将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。该技术通常由参与催化某种化学发光反应的酶(如HRP或ALP)来标记抗原或抗体,在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体‐待测抗原‐酶标记抗体复合物,经洗涤后,加入相应底物(发光剂),由酶催化和分解底物发光,由光量子阅读系统接收,光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大,再把它们传送至计算机数据处理系统,计算测定物浓度。

2.分子诊断的几类技术

(1)聚合酶链式反应(PCR)技术

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

(2)基因芯片技术

简单的讲,基因芯片就是按照预定位置固定在固相载体上很小面积内千万个核酸分子所组成的微点阵阵列,在一定条件下,载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核算片段进行标记,在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

基因芯片技术国外市场美国illumina公司一家独大。在SNP芯片研究领域,美国illumina公司毫无疑问是霸主,illumina公司凭借自己开发的GoldenGate技术和infinium专利技术一直在SNP芯片领域处于垄断地位。illumina的全基因组表达谱芯片是目前唯一一种可以达到探针30倍重复的表达谱芯片,其他的芯片都只能达到1-8倍技术重复。因此illumina的全基因组表达谱芯片的重复性是所有芯片中最高的,其重复性R2>0.996,并且基于第三代基因芯片独特的微珠芯片生产工艺,芯片生产成本较低,信噪比和灵敏度都非常高,其灵敏度≤1:250,000,芯片检测结果和qPCR相关系数R2=0.97。因为illumina所占的市场份额越来越多,2012年6月另一基因芯片大厂家Nimblegen公司,正式宣布退出基因芯片市场。

国内基因芯片制造水平低,相关的企业规模小、投入也少,远达不到国外的水平。所以国内的相关公司均以引进国外基因芯片,提供检测服务为主。不过,随着基因芯片的应用推广,一些公司也开始涉足基因芯片制造。上市公司达安基因,业务以体外诊断为主,产品主要是试剂盒,但也开始涉足基因芯片制造。而另一以基因检测服务著称的大企业华大基因,则通过收购国外公司进入基因芯片制造领域。

美国上市公司CompleteGenomics公司有自己基因芯片和芯片检测设备。但该公司2011年的业绩只有2000多万美元,其基因测序服务成长大大低于预期,股票跌破发行价,最后被中国华大基因收购。联川生物在microRNA芯片领域也小有名气,也是唯一一家国产的microRNA芯片,该芯片最大的特点就是更新速度极快,一般新的数据库发表后,第一个将芯片更新到最新版本的就是联川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市场,因illumina公司2006年收购了高通量测序领域NO.1的Solexa公司,成为唯一一家即拥有芯片平台又拥有高通量测序平台的供应商,illumina认为在microRNA领域,高通量测序有不可比拟的技术优势,必然会取代芯片,所以于2010年停产了microRNA芯片。

生物芯片技术正逐渐成为分子诊断的主流技术和未来发展方向,在我国尚处于发展初期,国内生物芯片技术与国外有一定差距,国内仅有少数几家企业具备进入该领域的实力。
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