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RT-PCR分子诊断设计——酶选择的考量点

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RNA 和DNA 目标片段的成功扩增关键在于合适的聚合酶选择。

RT-PCR与标准PCR技术相比,增加了一步不确定性非常强的步骤——对于RNA模板的逆转录过程。在病毒检测和肿瘤相关检测中,需要从非常小的样本量中扩增特定RNA。与常规RT实验相比,用于临床检测的RT-PCR,必须考虑到临床样本中的酶反应抑制组分,以及需要更高的RT温度使得扩增特异性引物正确结合到特定RNA区域。如果待扩增区域是低丰度的或是困难的二级结构,更加需要慎选能从困难模板中产生最佳cDNA合成效果的RT酶。事实上,具有更高热稳定性的RT酶,是具有困难二级结构的转录本的首选,因此传统的双酶RT-PCR 体系中,常常选择AMV作为RT酶。

在此基础上,罗氏为您考虑得更多——5min完成RT反应的热启动RT酶!

罗氏CustomBiotech 提供了一种新型实时PCR 反应扩增酶,可同时用于DNA 和RNA 两种靶标扩增的单一酶—— HawkZ05 Fast 聚合酶。HawkZ05 Fast 能在单管中运行一步法RT-PCR,操作流程大大简化。

HawkZ05 Fast 是一种热启动酶,使用寡核苷酸适配体修饰。适配体作为温度依赖性的分子开关,将反应液温度降至+55℃以下,适配体的三级结构引起RT活性和DNA链碱基延伸活性关闭,而在高于+60℃的温度,聚合酶的活性获得完全激活。

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HawkZ05 fast聚合酶的扩增稳健性——在20μl反应体系中,加入不同比例的RNA (HCV-Vic)和DNA (HPV-FAM)模板,使用HawkZ05 fast聚合酶进行检测。顶部图中,固定拷贝数的RNA目标片段和高/中/低浓度的DNA目标片段混合在一起进行检测。对应的,在底部图中,固定拷贝数的DNA目标片段和高/中/低浓度的RNA目标片段混合在一起进行检测。在所有的组合反应中,这两个靶点的扩增结果都获得了很好的一致性。

HawkZ05 Fast聚合酶的性能优势

■ 使分子体外诊断试剂产品的PCR 操作更便捷和灵活
热启动激活的HawkZ05 Fast 聚合酶可同时用于RNA 和DNA靶标检测,如HCV 和HPV。

■ 针对棘手靶标进行试剂盒开发
在60-65℃条件下进行高温逆转录,依然具有极高的RNA 持续合成能力,对低拷贝和复杂二级结构的RNA靶标实现可靠扩增。

■ 快速获得检测结果
44 分钟内即可运行完成RT-PCR 反应,大大缩短检测周转时间(TAT),同时不损失检测灵敏度和线性范围。

■ 轻松应对粗提样品
Hawk Z05 Fast 聚合酶对PCR 抑制剂如肝素、SDS 等显示出高耐受性,对棘手的临床样品类型如粪便或鼻腔拭子等具有稳定的检出性能。

■ 适用于各种PCR 检测应用
可选择无甘油酶形式,用于冻干类产品设计,或用于改善酶溶液加样准确度。

■ 杰出的检测一致性
罗氏的标准化生产流程,及基于多指标严格的QC(质量控制)放行检验,提供了Hawk Z05 Fast 高度的批次间一致性,为体外诊断(IVD)试剂盒生产商和终端使用奠定了高质量的原料基础。

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