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当下新冠病毒检测的需求:大规模及现场筛查



2月8号,国家科技部发布的《新型冠状病毒(2019-nCOV)现场快速检测产品研发应急项目申报指南》拉开了新冠免疫快检的帷幕。

2月27日,《中华检验医学杂志》“新型冠状病毒”专题,在线发表了武汉大学人民医院在抗击新型冠状病毒肺炎一线诊疗中的最新临床实践成果《血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值》,为COVID-19临床诊疗的实验室检测技术的应用提供了有利的数据和参考。

3月3日发布的第七版新冠诊断方案正式将IgG/IgM的检测加入新冠病毒的确诊方案之中。据了解,目前已有的免疫检测试剂生产商约21家,其中90%都有侧向流层析的产品,然而持有国家药监医疗器械注册证的免疫侧向流快诊生产企业目前只有2家。侧向流层析产品方便易用,适合基层大规模筛查以及现场检测。但从侧向流层析产品研发角度来看并不容易,新产品的开发除了需要考虑检测抗原抗体的特异性和合适标志物外,还需要考虑体系的搭建和试纸条的结构设计。传统的侧向流层析试纸条主要由样本垫,释放垫,硝酸纤维素膜和吸收垫四个部分组成。每个组分的表现会影响到整个试纸条性能,因此针对每个部分不同的需求准确选择恰当的材料是高灵敏产品的前提。

首先是样本垫的选择,样本垫的选择需要综合考虑样本量的大小和样本垫基本的物理参数比如厚度,吸水量和爬速等。对于一些特殊的样本还需要去除干扰物质的能力如全血样本中的血红细胞以及唾液样本中的小颗粒物质。此外如果是血液类样本,抗体检测还容易受到一些物质如类风湿因子,非特异IgM等的干扰,为了减少这些物质与反应膜的非特异性结合,增加信噪比,通常会将一些封闭剂加在样本垫上,因此还需要考虑样本垫的强度。在此次COVID-19侧向流免疫层析产品上检测所用到的的样本主要有全血,血清以及唾液和鼻腔拭子。对此,Whatman结合样本种类的不同以及样本量的多少有如下的推荐:

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Table 1. 样本垫性能表

其次是结合物释放垫,释放垫虽然整个侧向试纸条最小的一个部分却也是除硝酸纤维素膜之外最重要的部分。结合物释放的动力学决定了样品中待测分析物的检测量,最理想的状态是最后的待测分子进入结合垫的时间与结合物在释放垫上完全释放的时间一致。因此选择一个合适的释放垫至少需要考虑以下四个因素:1)材质的亲水性,目标物质和结合物可以顺利的到达反应膜;2)材料结构开放,使得结合物和样品都能够快速的穿过释放垫;3)释放垫背景干净,如不含盐离子和其他容易引起非特异性反应的物质;4)批间性能的稳定性,有效的帮助降低成品的批间CV值。Whatman 目前可以提供一系列拥有不同吸收和释放性能的玻纤材料以及聚酯材质的释放垫供客户选择,同时我们确保用于诊断的玻纤产品的生产均采用去离子水,确保产品中没有额外的盐离子富集,部分释放垫产品如下表所示:

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Table 2. 释放垫性能表

整个侧向流免疫的组件最重要的就是NC膜了,NC膜是整个侧向流层析产品的核心,是目标蛋白被捕获以及检测的地方,检测的灵敏度和动力学特性很大程度上取决于蛋白吸附和毛细管作用,这些都与膜材的物理和化学性质密切相关。当我们进行膜材选择的时候需要考虑以下几点因素:1)表面活性剂与蛋白,市售的硝酸纤维素膜都含有表活。表活的主要作用是在于使膜材具有亲水性以及帮助蛋白的包备,但也会出现某些表面活性剂或者表面活性剂含量过高完全破坏单抗结合位点,导致试剂在侧向流层析产品上完全无法发挥检测作用的现象;2)样本,一般来说粘度越高的样本爬速越慢,考虑到整个体系完成的时间一般情况下建议选择爬速较快的膜,但有时也需要考虑捕捉剂的亲和力;3)捕获试剂和目标物质的结合解离速率,因为待检物质能够在T线处停留的时间一般小于1分钟,因此侧向流层析产品倾向于高亲和力的抗体。但与此同时捕获试剂的结合解离速度也是非常重要,即使不同的分子间可能拥有相同的亲和力,但是其结合和解离的速率会很大的差别:

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Fig. 1 同一抗原与不同抗体之间的实时结合解离动力学图谱(数据通过Biacore的SPR技术获得)

如上图所示,尽管两者的亲和力一致,但左图抗原抗体的结合解离速度远低于右图。如果选定的捕捉剂对于目标物质的结合速率相对较低,但又希望能够在一定的检测时间内保证高灵敏度,则可以考虑通过测试不同的表活以及表活浓度的膜材来实现;4)爬速,对于固定的膜,捕获试剂以及分析物浓度的组合,降低流动速度往往能提高检测的灵敏度,但爬速过慢又可能会造成假阴或者高背景的现象。因此膜材的选择是一个多因素综合考虑和平衡的过程,对此,Whatman共推出了五个系列共16种膜类产品以满足不同类型客户筛选膜材的需求:

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Table 3. 反应膜产品性能表

最后是吸水垫,吸水垫位于侧向流层析检测装置的末端。吸收垫最初的功能是吸附多余的样本和防止回流,当测试结束之后,膜开始干燥液体可能会发生反向流动,吸收垫收集的液体此时开始成为样本的来源,这种反相流动效应会导致后续报告解读出现假阳现象。为了避免这一现象的出现,吸收垫的选择往往建议是吸水量大于样本量,但也需综合考虑尺寸及爬速等因素。此外,提高吸收垫的吸水量也能够有效增加待测样本的含量。仅吸收垫的部分,Whatman目前就有超过五种的产品供客户挑选,下表列出常用的三种产品:


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Table 4. 吸收垫产品性能表

我们都知道灵敏度和稳定性是侧向流免疫层析产品重点关注的两个方向,针对每个部分不同的需求准确选择恰当的材料是高灵敏产品的前提,而材料的批间以及供货的稳定则是稳定性的重要保证。这是研发和生产人员考虑的问题同时也是Whatman所关注的点。事实上早在2013年,我们的全球诊断技术支持Dr Klaus Hochleitner在MDDI上发表的一篇文章中就曾提到“对于灵敏度要求更高的定量产品,反应膜的稳定性显得尤为重要”,并就不同批次的FF120 HP在第三方实验室进行了重复性验证:三个不同批次(D013024, roll 15A/T; G1471608, roll 7A/Q; G1471610, roll1A/T)的FF 120 HP 分别制备成试纸条,每个批次二十根,使用含有不同浓度myoglobin(0, 0.25, 2.5 和10 ng/ml)的血清样本分别测试,15分钟后用Qiagen 的ESEQuant reader进行读数并计算:

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Table 5. FF120 HP在梯度浓度(Myoglobin)测试中的表现(ESEQuant reader)

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Fig.2 不同批次FF120 HP 的检测结果(Myoglobin)

结果如上所示:不管是从线性角度还是重复性角度,FF120 HP 的答卷都是完美的。当然,在此次新冠的快速层析产品的开发中,无论是在国际客户还是在国内客户处,我们也都有看到FFHP 系列的优异表现。

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