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浅谈新冠病毒免疫学快速检测技术研究与应用

2019年12月以来,我国出现新型冠状病毒肺炎疫情,随着疫情的蔓延,国内其他地区及境外多个国家也相继爆发[1]。新冠肺炎疫情发生后,中国全国万众一心、众志成城,采取了最全面、最严格、最彻底的防控举措。经过艰苦努力,目前疫情防控形势积极向好的态势正在拓展,经济社会发展加快恢复。中国人民完全有信心、有能力、有把握打赢这场疫情防控阻击战。目前,国内疫情形势趋于良好,但放眼国际,新型冠状病毒感染已肆虐全球,全球新冠病毒感染人数与日俱增,所有人都在共盼春来。

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截止至2020年3月21日13点,中国国内累计确诊81421例、现存确诊6278列、累计治愈71882例、累计死亡3261例;国外累计确诊190884例、现存确诊163386列、累计治愈8015例、累计死亡19483例。除中国以外,当前新冠疫情最为严重(累计确诊病例破10000例)的6个国家为意大利、西班牙、德国、伊朗、美国、法国。

如何快速、准确筛查并确诊新冠肺炎患者成为当前全球战“疫”的重中之重。

目前,国内生物公司研发的新冠病毒检测试剂盒主要有两种,一种是新型冠状病毒核酸检测试剂,一种是新型冠状病毒免疫检测试剂,可以分别归属到体外诊断(IVD,In Vitro Diagnosis)细分市场中的分子诊断和免疫诊断。IVD企业快速的应对,也表明了近年来中国体外诊断领域的巨大进步。

由卫生健康委办公厅、中医药局办公室发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中,关于实验室检查部分的病原学及血清学检查指出了目前诊断方法及依据。核酸方法检测下呼吸道标本(痰或气道抽取物)更加准确。在实际检测工作中,标本的选择以及采样操作是否规范直接影响到核酸检测准确度。

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分子诊断方法耗时长,常规PCR方法需要在高等级PCR专用实验室由专业人员操作完成;封闭管路的新兴PCR方法成本较高,检测通量限制了总体检测速度;而基因测序技术完成检测需要将标本运送至专业测序实验室,时间成本与费用高,难以基层普及。需要其他方法学诊断试剂互补,取长补短。

在感染的早期核酸诊断和免疫学诊断需要并行检测,互为补充,可提高临床检测准确度。对于新冠病毒(COVID-2019)的检测,中华医学会检验医学分会主任委员同样表示荧光定量PCR法的检测结果假阴性较高[3],荧光定量PCR方法依赖于标准曲线或参照基因来测定核酸量,往往会有诸多限制因素,比如抑制剂、扩增效率等限制。在试剂盒产品研发过程中,各种困难会接踵而至,原材料制备或挑选、生产工艺选择、研发人员能力、技术手段使用,每一个环节都有可能产生偏差,误差累计起来导致试剂盒产品灵敏度出现差别。做抗体检测,先要找到抗原,生产企业一般需要从几十种抗原里挑选出几个适合的原料用于研发,上游原料企业能否稳定、可靠供应也是需要考虑的问题。前期试剂盒研发过程中,由于缺少阳性样本,“巧妇也难无米之炊”,导致很多企业在试剂开发前期性能提升进度停滞不前,极大地拖延了产品用于缓解疫情的时间。因此,在此也呼吁相关标本管理政策可以合理优化,让珍贵的临床资源合理使用,让生产企业获得标本建立质控品和参考品,研制出性能优异并且符合临床需求的诊断产品,促进医疗行业快速、健康成长。

随着试剂行业各企业的投入与探索、与医疗单位的合作与研究,以检测新冠病毒感染为目的的不同方法学试剂逐步增多。免疫方法学上有需要仪器设备的化学发光免疫法、酶联免疫法、荧光定量层析法、上转发光层析法、免疫比浊法等;还有无需匹配检测设备的胶体金层析法。

化学发光产品及酶联免疫法需要配套大型全自动检测设备,通量高、投入大,适合待检样本多而自动化水平高的医疗单位;荧光定量层析法、上转发光层析法通量较上面两种方法较小,配套检测设备为小型手动或半自动设备,在定量检测方面适用于中、小型医疗单位;而像新冠病毒相关检测这类定性项目,对于存在快速检测需求的医疗单位更加适用于胶体金层析法试剂。

胶体金技术在快速检测新冠病毒上具有很大的优势。胶体金试剂使用方便快速、室温储存和运输,物流成本低、应用范围广,属于疫情防控急需的快速、简易筛查新型冠状病毒感染患者的诊断试剂。从实施工艺方面来讲,对试剂条采取冻干技术要比烘干工艺好,冻干工艺不仅可以消除标记物垫的边缘效应[4],避免生物原料活性降低,还可以改善标记物附着的微观空间结构,使标记物释放速度得到显著提升。

伴随疫情由国内转为国外的大形势,无需检测设备的胶体金层析法试剂也成为IVD产品援助国际医疗的重要组成部分。胶体金层析法试剂的产品使用方式及基本特点也更为符合国外用户的习惯与需求。胶体金类产品质量轻巧,国际物流过程中无需冷链,产品运费大幅降低。国外医疗终端的客户使用试剂前仅需要阅读产品说明书,随后即可完成所需的检测。避免其他方法学产品所需匹配检测设备的安装、计量、校准的工作。现阶段,我国疫情逐渐平息,即将获得国内战“疫”的胜利;而国外众多国家的人们正在经受新冠疫情的肆虐。此时此刻,是中国诊断行业援助国际社会抗击疫情的最佳时机。让IVD国际市场飘扬起中国品牌与中国速度大旗,让国际社会承认国内IVD产品的性能优异、质量可靠,需要我辈共同努力。

胶体金检测试剂在检验原理上主要有两种,一种是夹心法,又分为采用双抗原夹心法检测新冠病毒总抗体,与采用双抗体夹心法检测新冠病毒特异性抗原;另一种是采用间接法或捕获免疫方法检测新冠病毒IgM、IgA、IgG抗体。由于新冠病毒感染属于下呼吸感染疾病,因此采用鼻咽拭子为样本的双抗体夹心法在样本选择上可能存在较高漏检风险,而采用血液为样本的检测方法可靠性相比较要更高。

从机体对病原体的体液免疫应答来看,病原体的特定蛋白如COVID-19的S蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答,最早出现的抗体是IgM及其后的IgA抗体,然后是IgG抗体。IgM是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要抗体,是机体抗感染免疫的“先头部队”。IgA结构上有单体、双体、 三体及多聚体之分。按其免疫功能又分为血清型 及分泌型两种。分泌型IgA具有抗细菌、抗病毒、抗毒素的作用,有多种抗体活性,在呼吸道、消化道黏膜防御机制中发挥重要作用[5]。IgG是体液免疫应答产生的主要免疫球蛋白抗体,其在体内含量高、分布广,一般出现感染的现症阶段或者恢复阶段。急性感染的一般过程中,当IgG抗体出现后,浓度会持续增高,IgA抗体与之同步升高,IgM则持续降低,直至消失,IgG抗体会较长时间存在。总体上说,IgM、IgA、IgG三种抗体分型的检测可有效用于疾病病程发展的评估[6]。

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抗体的分类(来源:网络)

刺突(S)蛋白[7]是新冠病毒的关键组分,它含有S1和S2两个蛋白亚基。S1能够促进病毒结合到宿主细胞受体的能力,其含有一个重要的C端受体结合结构域,正是这个位置负责和受体结合。COVID-19 S蛋白的抗体具有中和病毒的作用,S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合,对于病毒颗粒进入细胞至关重要,是病毒感染宿主细胞的关键因子。COVID-19和2003年的SARS病毒一样,都是通过识别人类宿主的ACE2蛋白从而进入细胞的,尤其是,S蛋白结构域的细胞受体结合区(Receptor binding domain,RBD)直接参与了宿主受体的识别,该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化。采用S蛋白作为抗原的检测到的IgG抗体的出现并持续升高,应具有很好的预后及康复指示价值。

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冠状病毒形态结构示意图(来源:网络)

在诊断试剂生物原料筛选及工艺研制过程中,我们经过近一个月的实验研究,发现新冠病毒S1蛋白与S2蛋白按比例标记的试剂灵敏度及特异性较为良好,而采用N蛋白为原料的产品特异性不良。针对感染早期病例,单独检测IgM抗体不如IgM+IgA检测阳性检出率好。对于感染中后期,IgG抗体可有效提升阳性检出率。因此多抗体联合检测结果更加可靠。

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新冠病毒刺突蛋白的冷冻电镜图像(来源:《Science》2020年02月21日刊)

当前,国内外免疫方法的新型冠状病毒诊断产品主要是总抗体以及IgM、IgG抗体联合检测试剂,而新型冠状病毒特异性IgA抗体检测属于空缺状态。全球首创可检测COVID-19特异性IgA抗体产品现已面世。北京中检安泰诊断科技有限公司新上市的“新型冠状病毒(COVID-19)IgA/IgM/IgG抗体联合检测试剂盒(胶体金法)”可对新冠病毒(COVID-19)特异性IgM、IgA、IgG抗体进行联合检测,而且使用新冠病毒S1蛋白与S2蛋白进行标记,采用冻干工艺确保产品具有高灵敏度和特异性,填补了新冠病毒快速免疫诊断多项抗体联合检测的空白市场。

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目前该试剂盒已获得欧盟CE准入资格,作为全球独家研发出新冠病毒IgA/IgM/IgG抗体联合检测的厂家,中检安泰具有10年层析技术、研发经验,ISO13485体系认证,产品工艺稳定可靠,将为全球疫情阻击战、为临床精准检测提供最新武器。

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ISO13485质量体系认证证书
产品CE证书

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CE主文档

COVID-19 lgA/IgM/IgG抗体联合检测试剂在患者的急性感染期以及恢复期均可用于检定,能与对感染早期高敏感性的核酸检测试剂形成有效互补,且无需仪器直接判读。

在武汉市,由中国疾控中心病毒所使用59例的临床确诊患者样本进行评估后的反馈结果看,中检安泰生产的新型冠状病毒(COVID-19)IgA/IgM/IgG抗体联合检测试剂盒阳性检出率达到了90%;公司研发实验室采用疫情爆发之前采集的随机样本检测,试剂特异性为94.5%。

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使用中检安泰COVID-19 IgA/IgM/IgG抗体联合检测试剂对比某已上市W公司的新型冠状病毒IgM+IgG抗体检测试剂;检测同一份新型冠状病毒早期感染患者的样本,并进行梯度稀释平行对比验证两种产品灵敏度水平差异。

通过比对,确认中检安泰诊断科技有限公司产品灵敏度要高于已上市W公司产品灵敏度水平,满足临床使用中对已感染或疑似患者的辅助筛查。

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指标意义

IgA/IgM/IgG抗体联合快速检测可用于疾病病程发展的评估。T1指IgA和(或)IgM的检测结果,阳性结果提示可能为新近发生感染,可用于辅助诊断COVID-19的早期及现症感染;T2是IgG检测的结果,单独IgG阳性结果提示可能发生感染有一段时间,可用于辅助诊断COVID-19的中后期或既往感染。

新冠病毒IgA、IgM抗体检测可以很好的补充核酸阴性新冠感染患者的诊断,同时对于无症状感染患者的诊断也表现出较好的价值;聚焦早期诊断,尽可能缩小窗口期,对疑似病例的早诊断具有重要研究价值。

中检安泰作为全球医疗行业的一份子,砥砺奋进,愿为全球防疫做出应有贡献。
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