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核酸检测常态化,遇到“假阳性”该怎么办?

新型冠状病毒感染引起的肺炎疫情至今仍在全球肆虐,且感染病例数在突破2000万后仍在继续攀升。经过全国上下艰苦努力,我国新冠肺炎疫情防控向好态势进一步巩固,为全面落实“外防输入、内防反弹”的总体防控策略,防控工作已从应急状态转为常态化。

随着各地新建符合安全级别的PCR实验室与核酸检测技术的普及,病毒核酸检测常态化已成为落实疫情常态化防控“四早要求”的首要措施与关键举措。

新冠肺炎疑似病例的确诊,须“具备以下病原学证据之一:

1. 实时荧光RT-PCR检测,新型冠状病毒核酸阳性;2. 病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源。

相比于病毒基因测序,病毒核酸检测因更“接地气”,也更容易更适合推广,成为了目前诊断新型冠状病毒肺炎的“金标准”。

当遇到标本采集的质量、患者所处的病程及检测试剂盒的灵敏度等因素可影响检酸检测结果。样本采样部位不佳、采样量不足、保存不当、病程早期病毒分泌量少及检测试剂灵敏度不佳常导致新冠病毒核酸检测的假阴性结果。但随着大批量临床样本的实验室检测不断增多,除了此前多篇报道的“核酸检测可能存在假阴性”外,“假阳性”也是一个不容忽视的问题。

为什么会出现假阳性的结果?如何判断检测结果是假阳性?我们应该如何尽量降低或避免假阳性结果,保证核酸检测结果的准确性呢?出现了假阳性该怎么办?......

要知道以上“假阳性”的相关问题,我们可能要从PCR技术的原理聊起。

什么是荧光定量PCR?

首先给大家介绍一下临床上用于新型冠状病毒核酸检测的实时荧光反转录聚合酶链式反应,也就是人们常说的PCR。

实时荧光RT(real-time)-PCR,即实时荧光反转录聚合酶链式反应。它首先将提取的病毒基因组RNA,通过反转录变成DNA(cDNA)。然后再用病原体特异性的引物,以cDNA作为模板扩增病原体核酸序列。因为扩增的过程中荧光染料能同步整合在产物上,所以研究者可以通过荧光信号的强弱,进行实时检测。


武汉市第四医院检验科核酸检测PCR扩增

实时荧光RT-PCR技术具有特异、快速、敏感、产率高、高通量、简便等突出优点,为人类疾病的防治提供新的检测手段,已成为临床实验室常用的操作技术之一。大多数病原体都可通过PCR检测,除了新冠病毒外,还有乙肝病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)等,但在实际PCR实验过程中极易发生污染,引起检测结果的假阳性。

什么是“假阳性”?

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但作为一种高灵敏度的检测手段,也是因为过于灵敏反而容易污染,PCR的实验结果也容易被各种无关的外源性DNA或RNA所干扰,极其微量的污染也能扩增后被检出,即在本不该出现荧光信号的阴性样本、阴性对照(生理盐水)或空白对照中出现了阳性的荧光信号,可能造成假阳性的产生与阳性结果误判。

引起PCR实验室污染的原因主要有哪些呢?

由于PCR技术敏感性特高,所以要求更高,影响因素也非常多,从样品开始采集到结果报告发出,任何一处细小的失误都会造成检测结果的偏差,极其微量的污染都容易导致样品出现假阳性结果。产生污染的主要途径如下:

1、标本的污染

(1) 收集标本的容器被污染;

(2) 标本放置的时候,由于密封不严溢于容器外;

(3) 容器外粘有标本造成相互间交叉污染;

(4) 标本核酸模板在提取过程中,由于加样器污染导致标本间污染;

(5) 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。


武汉市第四医院检验科正在进行核酸提取加样

2、试剂的污染

主要是在PCR组分试剂配制加样过程中,由于加样器、容器、双蒸水、阴性对照及其它试剂被PCR核酸模板或阳性对照污染。

3、扩增产物污染

实验室扩增产物的遗留污染是PCR实验室中最主要、最常见的污染。因为 PCR 产物拷贝量大,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的 PCR 产物污染,就可形成假阳性。

气溶胶污染是最可能造成PCR产物污染的主要原因。在离心机离心、空气与液体面摩擦时、在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时、闭盖时,及污染加样器的反复吸样吹打都可形成气溶胶而污染。当这些气溶胶里长短不一核酸片段的小颗粒在实验室里(或移液器内)日积月累,沉降到实验台面、PCR仪、移液器、吸头盒等地方,当达到一定浓度,很可能会弥漫到样本中,最后导致PCR实验结果出现假阳性。

PCR实验室的污染应急处理方法有哪些?

根据国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组2020年7月10日发布的《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》,PCR实验室的污染应急处理方法如下:

1、标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时

立即用吸水纸覆盖,并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配,24小时内使用。

2、标本倾覆造成实验室污染时

保持实验室空间密闭,避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时(如大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸实验室,剂量为2g/m3,熏蒸过夜;或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾,用量8ml/m3,作用1-2小时;必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸:高锰酸钾8g/m3,放入耐热耐腐蚀容器(陶罐或玻璃容器),后加入甲醛(40%)10ml/m3,熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。

3、清理污染物时严格遵循活病毒生物安全操作要求

采用压力蒸汽灭菌处理,并进行实验室换气等,防止次生危害。

有哪些措施能预防实验室污染,防止假阳性的产生呢?

1.布局合理的实验室是保证实验能正常进行的前提

PCR实验室原则上至少设有试剂准备区、样品制备区,扩增区三个单独的工作区域,并设有专用走廊,各工作区域应设缓冲间。各区在空间上完全独立,不能相通。各区有独立的通风系统,扩增前和扩增后区域应具有独立通风系统,扩增后区域保持负压状态,其它区域保持正压或常压状态,防止扩增产物进入扩增前的区域,压差≥5Pa。进风口和出风口不能设在建筑的同一平面,要避免排出的空气被重新吸进实验室。

各区域只用于特定的操作,工作衣和清洁清毒物品不得跨区混用,实验室人员和物品应从试剂准备区到扩增区单向工作流动,不得逆向流动。


某医院PCR实验室平面图设置

2.做好质量控制

实验室应建立合理、科学的室内质控标准操作规程(SOP),质控应该样本处理到报告发放全程参与,新型冠状病毒核酸检测严格执行“三个阴性样本随机放在临床标本中间同时参与检测全过程”的质控策略,以及复检规则的设置等,可有效避免假阳性结果的发生[1]。

3. 试剂耗材的摆放

配制试剂时应正确使用加样枪,使用带滤心的枪头,尽量一次性吸完,不要反复多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶。核酸提取结束后,取下废弃试剂和耗材,用自封袋密封后放入医疗废物桶中。


带滤心的枪头

4. 核酸扩增

扩增产物是最容易出现的污染,通常一次典型的PCR扩增可以产生109拷贝的靶序列,若气溶胶化,最小的气溶胶都会产生含106拷贝的扩增序列,这些气溶胶的累积会污染实验室内的试剂、仪器设备和通风设备,使检测结果出现异常[2]。因此,应对核酸扩增的每一个环节进行严格的规范操作。

(1)扩增反应液和样本核酸模板分装完毕检查管内液面高度一致后,加盖八联管盖,逐孔按紧,混匀离心后再次检查八联管有无渗漏。

(2)八联管转移至96孔扩增盘时再次确认管盖已封严,以防扩增过程中爆管导致实验室污染。


将扩增产物八联管放入“自封袋”内封严

(3)扩增结束后要及时将扩增产物从扩增仪里取出(禁止打开八联管),检查管内液面无变化后放入“自封袋”内封严,然后带出扩增区,不能随便丢弃,需按医疗废物处理。

5。实验结束后的清洁消毒

清洁消毒方法不当也是实验室污染的一个主要原因,实验结束后应遵从先清洁区域后污染区域消毒的原则,及时对实验室空气、设备表面、工作台面和地面等实施有效的消毒。

(1)紫外灯

工作结束后用可移动紫外线灯进行工作台面照射;

开启超净工作台或生物安全柜内的紫外线进行照射;

夜间开启固定紫外线灯进行照射。


武汉市第四医院检验科核酸提取完照紫外消毒

(2)70%乙醇

每天工作开始前及工作结束后拭工作台面、设备及物品表面;

日常仪器和架子的维护清洁。

(3)0.55%次氯酸钠溶液(新鲜配置)

实验室工作台面和样本外溅时使用;

开盖机、生物安全柜等日常擦拭。

(4)PCR Cleaner( PCR污染清除喷雾剂)

PCR Cleaner( PCR污染清除喷雾剂)是去除实验室操作台表面DNA的即用型喷雾剂,用于去除PCR工作台、实验室机电产品、试验台表面和实验仪器设备表面上残存的核酸,能快速有效地清除DNA或RNA污染,也是PCR实验室常见的污染清除利器之一。

另外,加强实验室通风,真的非常重要!!!!!

总结下来,

实验室防污染原则

预防为主,严守章程!


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